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文/华中农业大学陈昌福，武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军
预计阅读时间/13分钟
陈昌福有话说
致病性细菌耐药性问题，与21世纪人类健康的密切相关性已经逐渐成为世界各国科学家的共识。世界卫生组织以及我国等多个国家，为了遏制细菌耐药性蔓延而制定了相应的行动计划。
为了响应我国国家卫生健康委等多个部门联合制定的《遏制细菌耐药国家行动计划（2016-2020年）》和《遏制微生物耐药国家行动计划（2022~2025）》，农业农村部也数次颁布了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划》。
虽然我国正在强调无抗养殖等，但是，迄今为风暴娱乐止，采用水产用抗微生物兽药，治疗水产养殖动物的细菌性疾病，依然是国内外控制水产养殖动物细菌性疾病最有效的治疗方法。而在采用水产用抗微生物药物治疗患病水产养殖动物疾病之前，完成从患病水产养殖动物体内获得分离菌株，并且对分离致病性菌株完成药物敏感性实验，是确保实现科学、精准、高效治疗患病水产养殖动物的前提。
本文指出了在我国部分水产养殖区域的水产服务人员，在完成从患病水产养殖动物体内获得的分离菌株的药物敏感性实验时，采用的药敏实验方法是相对简单纸片法或者牛津杯法，获得检测结果虽然可以证明供试药物是否具有抑、杀菌功效，但是，用这种定性的方法的获得的检测结果，是不能用于精准确定治疗患病水产养殖动物用药剂量的。这是实现科学、精准、高效使用水产用抗微生物兽药中需要改进的药敏实验方法内容。
抗微生物药物敏感性检测方法
及其对科学用药的重要性
摘要：本文针对水产养殖中介绍了对抗微生物药物进行药敏试验检测的重要意义及其用药剂量计算方法。旨在为科学地使用抗微生物药物、避免和减少致病性微生物对抗微生物药物产生耐药性。文章中对几种检测致病性微生物，对抗微生物药物敏感性的检测方法，进行了重点介绍，指出常用的纸片扩散法（K-B法）和牛津杯法只能用于抗微生物药物定性，而仅依靠K-B法获得的抗微生物药物敏感性检测结果，是难以用于实际治疗疾病时用药量计算的。抗微生物药物用药量的计算，需要依靠用试管内系列浓度稀释法，检测抗微生物药物对风暴娱乐注册致病性微生物的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。
关键词：抗微生物药物；药物敏感性试验；最小抑菌浓度；精准用药；用药系数
最近几年来，从事水产养殖业的人们均可以明显地感受到，对由各种致病性细菌引起的水产养殖动物传染性疾病，要实施有效的药物治疗已经变得越来越困难了。人们对于导致水产用兽药治疗患病水产养殖动物没有疗效的原因，先后已经列出了各种各样的推测：首先，有人认为是由于水产养殖动物因近亲繁殖等导致了水产养殖动物种质退化，在水产养殖过程中对养殖水体中常在的致病性细菌等的免疫抵抗力下降了，更容易感染各种致病性细菌了；其次，在单位面积水体中放养的水产养殖动物苗种数量大幅度增加，因为高密度形成的拥挤因子（crowding factor）等，对水产养殖动物产生的环境应激性刺激，致使水产养殖动物自身免疫系统的免疫防御功能遭受到抑制，对养殖水体中常在的致病性生物的易感性增加，导致了各种传染性疾病的多发；其三，因为近些年来不断地推广实施高密度、集约化的水产养殖方式，养殖水体中因为水产养殖动物未摄食的残饵与排泄的大量粪尿等，造成养殖水体中有机物大量积累引起养殖水体中的水质恶化，直接危及到水产养殖动物的健康等。这些因素都是能导致水产用兽药难以有效治疗患病水产养殖动物的重要原因。
在我国以往的水产养殖过程中，有一个常见的使用水产用兽药的方法，是直接导致当前水产用兽药难以有效治疗患病水产养殖动物的重要原因。这就是因为大多数水产养殖业者采用水产用兽药治疗患病水产养殖动物前，并没有做到清楚了解致病性生物对水产用兽药的敏感性及其敏感程度，不能做到选择适宜的水产用兽药做到精准用药治疗患病水产养殖动物的缘故。而是在采用水产用兽药治疗患病水产养殖动物疾病时，几乎都是在盲目、轮流地使用一些水产用兽药。盲目、滥用水产用兽药的结果，就是导致致病性生物对水产用兽药产生越来越严重的耐药性（drug resistance），长此以往水产用兽药在治疗患病水产养殖动物中也就失去了应有的治疗效果。
在水产养殖过程中滥用水产用抗微生物兽药防控水产养殖动物的细菌性疾病，无疑是对于遏制细菌耐药性快速蔓延不利的。多年来，我们一直提倡在防治水产养殖动物疾病过程中，需要检测致病性生物对水产用兽药敏感性的基础上，进行科学选择和精准使用水产用兽药。现在，已经有一些水产养殖业者开始行动起来，从患病水产养殖动物体内分离致病性生物，在完成对致病性生物的药物敏感性检测后，选择适宜的水产用兽药治疗患病水产养殖动物。毫无疑问，这是科学诊治患病水产养殖动物良好开端，是值得肯定、鼓励的方向与行动。
几种常用的药敏试验检测方法
利用从患病水产养殖动物体内获得的分离菌株，在离体条件下完成水产用抗微生物药物对分离菌株的药物敏感性试验，简称药敏试验（Antimicrobial Sensitivity Test，AST）。药敏试验是指供试药物抑制或杀灭分离菌株能力的试验。根据药敏试验的目的，常用的药敏试验检测方法有纸片扩散法、液体培养基稀释法、琼脂板稀释法、E-test法和自动化仪器法等，本文根据我国水产养殖区域的一些实验室采用的药敏试验方法，提出部分建议。
1.1纸片扩散法
药敏试验纸片法（disk diffusion method），又称Kirby-Bauer法，简称K-B法。是一种常用的抗微生物药物敏感性测试方法，用于评估细菌对抗微生物药物的敏感性，属于定性试验方法。纸片扩散法药敏试验的原理是，将含有定量的抗微生物药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗微生物药物物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制供试细菌的生长。药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对致病性微生物的抑制作用强弱。
该方法是将含有定量抗微生物药物的滤纸片（药敏片），贴在已接种了待测试的致病性微生物的琼脂表面上，药敏片中所含的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗微生物药物的浓度呈对数减少，在纸片的周围形成药物浓度梯度。导致药敏片周围能抑菌的药物浓度范围内的致病性微生物就不能生长，而处于抑菌范围外的致病性微生物则可以生长，因此，在药敏片周围形成透明的抑菌圈（图1）。不同抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩
图1 药敏试验中的纸片法抑菌实验情景
散速度的影响而可能有所不同，抑菌圈的大小即可以反映测试致病性细菌对药物的敏感程度（表1），并与该药物对测试致病性微生物的MIC呈负相关。
表1药物敏感试验结果判定标准
注意：（1）具体对于不同的致病性微生物菌株，不同的抗微生物药物纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。（2）药物敏感实验判定标准参考表1，多黏菌素抑菌圈；在9mm以上为高敏，6~9mm为低敏，无抑菌圈为不敏。
1.2牛津杯法
药敏试验牛津杯法（Oxford cup method），是一种用于测定抗微生物药物或其他抑菌物质活性的实验方法。用于评估细菌对抗微生物药物的敏感性，与纸片法一样，也是属于定性试验方法。牛津杯法药敏试验的原理是，将经过高压消毒洁净牛津杯（不锈钢小管，通常高约10mm，直径约6mm）置放于含有一定浓度的抗微生物药物定量添加在的固体培养基上，通过添加在牛津杯小管中的抗微生物药物物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制供试细菌的生长（图2）。药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对致病性微生物的抑制作用强弱。
图2牛津杯法的定性药物敏感性实验情景
1.3液体培养基稀释法
液体培养基稀释法（broth dilution method）是另一种常用抗微生物药物敏感性测试方法，属于能定量的药物敏感性测定方法。具体的实验方法就是将抗菌药物系列稀释后，与定量供试菌液共孵育一定时间后，观察供试抗菌药物对供试致病性菌株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。
该方法根据培养基容器规格也分为宏量（试管法，图3）和微量（微孔板法，图4）两种。无论是宏量试管法还是微孔板法，根据将供试抗菌药物在液体培养基中的含量，制备成2倍比稀释抗微生物药物（如200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、6.25……mg/L）。最后，在制备好含有系列药物浓度的定量培养中，添加定量的供试菌液。恒温培养一段时间后，观察药物对供试致病性细菌的MIC。
液体培养基稀释法的特点是做到了定量检测，具有检测结果准确，但是操作比较繁琐，消耗时间较长等。
图3液体培养基试管稀释法检测致病性细菌的最小抑菌浓度（MIC）
图4液体培养基微孔板稀释法检测致病性细菌的最小抑菌浓度（MIC）
如何利用药敏实验结果指导用水产用兽药治疗患病水产养殖动物
2.1要正确利用药敏实验方法与结果
譬如本文中介绍的纸片扩散法和牛津杯法，是属于利用药敏实验为供试药物定性的方法。其方法获得的检测结果只能说明供试药物是否具有抑制或者杀灭致病性生物的功能，譬如供试药物是采用的水产用抗微生物兽药的话，药敏实验结果只能说明这种供试水产用抗微生物药物是否还具有抑、杀菌效果。但是，并不能确定使用该药物剂量能有效地治疗水产养殖动物的细菌性疾病。因此，采用纸片扩散法和牛津杯法完成的药物敏感性实验，是不能根据这种药物敏感性实验方法获得的测定结果，获得精准用药的治疗疾病药物剂量的。
2.2水产用抗微生物药物对不同患病水产养殖动物的用药系数
日本学者采用日清制药公司生产的水产用医药品，在完成一系列药物敏感性实验研究后，确定了对日本养殖的几种鱼类的抗微生物药物的用药系数（coefficient of administration）。譬如以锦鲤（
Cyprinus carpio）为实验动物，采用日清公司生产的水产用医药品治疗患细菌性疾病的锦鲤时，要在饲料中添加MIC的8.1倍药物（即用药系数是8.1），才能在患病锦鲤摄食药物饲料后，其血液中的药物浓度达到MIC的抑菌浓度。
2.3环境因素对水产用抗微生物药物治疗患病水产养殖动物的影响
水产用兽药对患病水产养殖动物治疗疾病的效果，会或多或少地受到水体环境和给药方式等因素的影响。如养殖水体的水温和pH等均会影响到水产用兽药的用药效果。当人们对水产养殖动物口服给药时，还会受到作为水产用兽药载体的鱼用饲料的理化特性等因素的影响。
为了观察饲料颗粒大小、养殖水体pH和水温等因素对饲料中药物溶出速率的影响，Fribourgh等将盐酸土霉素添加在饲料中，使盐酸土霉素在饲料中的含量达到1.83 mg/g，制作成两种不同规格的圆柱形颗粒饲料，分别将其称为A与B型颗粒饲料。将这两种饲料投入到具有不同pH和水温的水体中以后，测定了两种不同规格药物饲料中的盐酸土霉素的溶出速度。
试验方法是分别用纱布将上述两种药物饲料包装后，沉放在1500.0 mL蒸馏水中，在经过3、9、15min，取出饲料包装袋并通过测定蒸馏水中的抗微生物药物含量，推定药物从颗粒饲料中的溶出状况。结果见表2。从表2中所列测定结果可以看出，水体的水温与pH均可以影响A和B型饲料中盐酸土霉素溶出的时间和速度。
表2盐酸土霉素从不同直径颗粒饲料中
* 因为盐酸土霉素是通过圆柱形颗粒饲料表面溶出的，将圆柱形饲料的半径以“r”代表，长度以“h”代表，表面积/容积比就可以下式计算。
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作者：华中农业大学陈昌福；武汉科研时代生物技术有限公司周鑫军。
编辑：郑燕云
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